技術文獻
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萊氏無膽甾原體PCR 檢測試劑盒說明書
1、 試劑盒簡介
流行性造血器官壞死病，是由無囊膜胞漿型虹彩病毒科蛙病毒屬的流行性造血器官壞死病毒
（EHNV）所引起的魚類疾病。病魚因肝臟、脾臟、腎臟造血組織和其他組織壞死而導致死亡。易感動物主要為赤鱸、虹鱒等種類，其中，赤鱸對該病毒極為敏感，幼魚和成魚都可受 EHNV 感染。EHNV 屬于虹彩病毒科蛙病毒屬（除新加坡石斑魚虹彩病毒之外）病毒，本公司針對蛙病毒屬的流行性造血器官壞死病毒( epizootic haematopoietic necrosis virus, EHNV)等病毒的主衣殼蛋白( MCP) 基因序列，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確 、安全、操作簡單、應用廣泛等特點及優(yōu)點。
2、 試劑盒組成
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積
核酸提取試劑： 樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2 5ml×1 管
500μl×1 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
EHNV 熒光 PCR 反應液
Taq 酶(5U/ul) 陰性對照
EHNV 熒光陽性對照 5ml×1 管
750μl×1 管
40μl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。
3、 樣本采集，存放及運輸
樣本采集
采集活的或瀕死的魚的腎或脾等組織，研磨PBS稀釋后提取核酸。或將細胞培養(yǎng)分離病毒的有CPE 的細胞懸液提取核酸病毒。
存放
研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（最多凍融 3 次）。
運輸
采用冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、 檢測步驟
DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)：
取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)、一管陽性對照和一管陰性對照之和， 對每個管進行編號標記。
每管加入 100 μl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本、陰性對照和陽性對照(陽性對照吸取前充分混勻)各 100μl，一份樣本換用一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下， 12 000 r/min 離心 10 min。
盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10μl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90μl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清， 即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
熒光 PCR 檢測
擴增試劑準備（在反應混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出熒光 PCR 反應液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應體系配制見下表 2。
表 2 每個樣品測試反應體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個PCR 管中各分裝15μL 的混合液，再分別加入樣本DNA 模板10μL，蓋緊管蓋，500 r/min
離心 30 s。
熒光 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）： 循環(huán)條件設置：
一階段，94 oC /4 min；
第二階段，95oC/15 s，60 oC/60 s； 40個循環(huán)；在每次循環(huán)的60 oC退火延伸時收集熒光。試驗檢測結束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結果。
5、 結果判定
結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。
質控標準
5.2.1陰性對照無Ct值或無擴增曲線。
5.2.2陽性對照的Ct值應<28.0，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。
結果描述及判定
5.3.1陰性
無Ct值或無擴增曲線，示樣品中無EHNV核酸。
5.3.2陽性
Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，示樣品中存在EHNV核酸。為進一步確診是EHNV，建議用普通PCR進行確認或測序。
5.4 有效原則
Ct>30的樣本建議重做。重做結果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
