TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒參考操作步驟及注意事項

TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒參考操作步驟：  
用二甲苯浸洗2次，每次5min；  
用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
PBS漂洗2次；  
用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時間、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min；  
PBS漂洗2次；  
制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應(yīng)在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。  
玻片干后，加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。  
PBS漂洗3次；  
可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；  
玻片干后加50μl converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。
PBS漂洗3次；  
在組織處加50~100μl DAB底物，反應(yīng)15~25℃×10min；  
PBS漂洗3次；  
拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。  
加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計200~500個細(xì)胞）并拍照。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）。  
 

注意事項  
進行PBS 清洗時，每次清洗5 min。  
 PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進行，請盡量除去PBS 溶液后再進行下一步反應(yīng)。  
在載玻片上的樣本上加上實驗用反應(yīng)液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實驗失敗。  
TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導(dǎo)酶活性的失活。  
如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。  
用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 pH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗凈時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。  
熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。  
試劑保存：未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 個月內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。  
9. 結(jié)果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細(xì)胞中可產(chǎn)生大量DN片斷，從而引起假陽性結(jié)果；而有些類型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞內(nèi)反應(yīng)，進而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。